研究文章结构生物学

肠细菌纤维素分泌系统的结构和调控

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科学进步  27 Jan 2021:
卷7号5,eabd8049
DOI:10.1126 / sciadv.abd8049
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  • Fig. 1 大肠杆菌 –如纤维素分泌系统和Bcs宏复合物的体系结构。

    (A)左:Bcs亚基的拓扑结构和功能作用(NS-EM,负染色电子显微镜; CDG,c-di-GMP; REC,接收器; NTPase,核苷三磷酸酶; TAC,转录抗终止复合物; NTD,N末端结构域; SIMIBI,信号识别颗粒,MinD和BioD; IM,内膜; TMD,跨膜结构域; TA,尾锚结构域; CBD,碳水化合物结合结构域; pEtN,磷酸乙醇胺; TPR,四肽重复序列; OM,外膜; CTD ,C端域)。右:通过单颗粒NS-EM获得的,包含大多数IM和胞质亚基的Bcs宏复合物的组装结构(1 )。 ( B)洗涤剂萃取和亲和纯化的Bcs宏复合物的Cryo-EM 2D类平均值。 (C)组装后的Bcs宏复合体内的密度分配。来自本地精制BcsB的六聚BcsB冠 五聚体(见下文)适合周质密度。 CDB结合的BcsA模型是通过Robetta中的同源性建模生成的,然后针对对应于BcsRQAB亚复合物的密度进行拟合和精制,通过局部精制对其自身进行改进。三明治式BcsR的晶体结构2Q2 在某些结晶状态下观察到,二聚体适合于顶端密度,BcsR采用扩展的四匝α1螺旋。二聚体BcsE的Robetta衍生模型 新台币 将其安装在与BcsA相反的膜近端密度上。 BcsE 新台币 副本以从头到尾的方向安装,与最近报告的交互数据一致(10)。对应于BcsE的区域 记录* -GGDEF * 即使经过局部精炼,也没有产生可解释的密度,这可能是由于构象异质性(参见下文)。大多数BcsB尾锚以及与BcsE相互作用的BcsF链(预计每个都折叠成一个跨膜螺旋)在3D重构的胶束中不可见。

  • Fig. 2 周质冠和非规范BcsAB合酶串联组件的结构,聚合和不对称性。

    (A)BcsB的结构比较 FL 来自的单体 大肠杆菌 (左)和 红球菌 (右)以PyMOL的表面(顶部)和卡通(底部)表示。 pdb,蛋白质数据库。 (B)顶部:从精制的BcsB衍生而来的六聚BcsB冠的模型 五角体在顶视图和侧视图中。下图:由相邻BcsB亚基之间的β-折叠互补形成的九链β-折叠的特写视图。 ( C)用考马斯染色的SDS-PAGE进行纯化,去污剂提取的全长 大肠杆菌 BcsB 他的 。 ( D)全长BcsB的Cryo-EM 2D类平均值 他的 。 ( E)左:纯化的全长BcsB的Cryo-EM密度重建 他的 具有密度拟合的BcsB 八进制。右:BcsB的复合原子模型 FL 在BcsRQAB组件中观察到具有可视化IM尾锚的hexadecamer。颜色编码与(A)中相同。 (F)BcsRQAB组装的结构,经过粒子扣除和低温电子密度的局部优化。单个BcsB 将副本安装在周质区域,并以精确的密度构建两亲性和跨膜C末端螺旋。 CDG绑定的BcsA同源模型适合跨膜和膜近端区域,并针对实验密度精制多肽骨架。 BcsR2Q2 晶体结构像 Fig. 1。指出了分开的结构模块和配体分子。

  • Fig. 3 纤维素分泌亚基BcsQ必不可少的结构和功能分析。

    (A)BcsRQ的结构 他的 异二聚体显示保守的SIMIBI折叠(在光谱彩色卡通中),结合的ATP(在黑棒中)和Mg ++ 离子(如紫色球)。 (BATP结合的BcsRQ的晶体结构 他的 复杂的。右:纯化的异源复合物的考马斯染色SDS-PAGE。 (C)ATP结合袋的特写视图。 BcsQ亚基以蓝色和石灰的形式显示为卡通,ATP配位残基分别以青色和棕褐色着色。水分子和镁 ++ 离子分别显示为灰色和紫色球形。 ATP和关键周围的残基显示为棒状。 (D)典型SIMIBI NTPases和肠细菌BcsQ中关键功能基序的主要序列比较。 (E)功能互补分析,检查体内关键BcsQ残基的作用。菌落纤维素的分泌通过荧光钙荧光结合来评估。结果代表至少六个生物学重复。测试所有BcsQ突变体的蛋白质表达以及与BcsR和BcsE伴侣(E)的相互作用。

  • Fig. 4 纤维素分泌亚基BcsR必不可少的结构和功能分析。

    (A)将BcsRQ复合物与SIMIBI超家族成员的两组分复合物进行比较。 (B)在本研究中解决的所有结构的不对称单元中发现的BcsR亚基的重叠。 (C纯化BcsRQ和Bcs的尺寸排阻色谱和SDS-PAGE分析 ΔNTD RQ。无标签BcsR和Bcs的分子量 ΔNTD R分别为7.4和3kDa。 (DBcsR结构域在体内纤维素分泌中的作用的功能互补分析。结果代表至少六个生物学重复。 (E在BcsR的背景下Bcs宏复合体表达后细胞BcsA的蛋白质印迹检测 新台币 缺失[GAPDH,3-磷酸甘油醛脱氢酶(上样对照)]。结果代表至少三个重复。

  • Fig. 5 多站点c-di-GMP识别和BcsRQ的结构R156E -BCSE 记录* -GGDEF * complex.

    (A未标记的BcsRQ的晶体结构R156E -E 217–523 与ATP / ACP(β,γ-亚甲基三磷酸腺苷或AppCp)和c-di-GMP形成复合体。 (B)全长BcsE域结构和功能验证的c-di-GMP结合基序(RxxD I位I和II),如本研究中所述。 (C)在BcsE中捕获的构象变化 记录* -GGDEF * BcsE之间的串联 217–523 [“Splayed” (10)]和BcsRQR156EE 217–523 (“封闭”)晶体结构。 (D)三组分复合物中c-di-GMP络合的特写视图。左:An |Fo |-| Fc|从包含二核苷酸之前的模型计算出的部分电子密度图,其轮廓为2.5σ。右:c-di-GMP协调的卡通形象。典型的I位I残基为青色;在蓝绿色中对次要的I位II残基进行了着色。 (E)BcsE上辅助I站点的功能验证 拍摄* module (R306通过等温滴定量热法。 Kd 使用两点结合模型计算值。

  • 补充材料

    肠细菌纤维素分泌系统的结构和调控

    维姆·阿比迪 ,Samira Zouhir,Meryem Caleechurn,StéphaneRoche,佩蒂娅·维奥洛诺娃·克拉斯特娃

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