研究文章病毒学

肠道人类腺病毒41的结构-儿童腹泻的主要原因

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科学进步 2021年年1月8日:
卷7号2,eabe0974
DOI:10.1126 / sciadv.abe0974
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抽象

F40和F41型人类腺病毒(HAdV)是引起腹泻以及与全世界腹泻相关的死亡率的重要原因。这些肠道HAdVs在组织嗜性和致病性方面与呼吸道和眼腺病毒显着不同,但这种差异的结构基础尚不清楚。在这里,我们介绍了一种肠溶性HAdV的第一个结构HAdV-F4​​1,该结构由冷冻电子显微镜确定,分辨率为3.8。与非肠溶性HAdV相比,该结构揭示了病毒体外部的广泛变化,包括衣壳蛋白IX的独特排列。该结构还提供了对HAdV结构保守方面的新见解,例如拟议的核心蛋白V位置,该位置将病毒DNA与衣壳连接,以及戊二烯基础蛋白的组装诱导构象变化。我们的发现为肠型HAdV适应根本不同的组织嗜性提供了结构基础。

介绍

腺病毒(AdVs)是人类常见的病原体,不仅会引起呼吸道,眼睛和肠道疾病,还会引起肝脏,泌尿道和/或腺样体质疾病(1)。迄今为止,已经分离,表征了100多种人类AdV(HAdV)类型,并将其分为7种(A至G)(2)。除了导致人类严重疾病外,几种AdV还在研究中作为针对传染病的疫苗载体,例如2019年冠状病毒病,中东呼吸综合征(MERS),埃博拉病,艾滋病,拉沙热和寨卡病(3)。这些努力包括基于HAdV-F4​​1的候选疫苗,该疫苗可在体内引发针对MERS冠状病毒的中和抗体(4)。 HAdV物种F的两个唯一成员,HAdV-F4​​0和HAdV-F4​​1,是仅有的具有明显胃肠道嗜性的HAdV。这些所谓的肠道AdV是导致腹泻和腹泻相关死亡率的主要原因(5),仅次于志贺氏菌和轮状病毒(6)。据估计,全世界5岁以下的儿童每年腹泻会导致约530,000例死亡(7)。因此,有强烈的动机去了解肠溶性HAdV的结构和分子基础。

AdVs是双链DNA病毒,具有〜35公斤碱基对的基因组,被隐藏在一个大(直径约950Å),呈二十面体对称的无包膜衣壳中(813)。在12个衣壳顶点中的每个顶点处,penton base(PB)亚基组织为均戊烯(14),锚固突出的三聚体纤维的N末端尾巴(15, 16)到衣壳。另一个所谓的主要衣壳蛋白是六邻体蛋白17),每个病毒体中有240个三聚体。六邻体是病毒体小面的主要结构组件,其组织结构使病毒体具有假性 T = 25对称(图1A)。六邻体装配体由少量衣壳蛋白IIIa(IIIa),VI和VIII(位于衣壳内部)和IX(暴露在衣壳外部)稳定(9, 10, 18)。迄今为止,有两个HAdV,HAdV-C5(11, 12, 19, 20)和HAdV-D26(21),以及单个衣壳蛋白或其亚结构域(14, 17, 22)已在高分辨率下确定了多种AdV类型的)。

Fig. 1 HAdV-F4​​1的整体结构。

(A)HAdV-F4​​1衣壳和核心结构的示意图。 (B)HAdV-F4​​1电子密度的表面表示,以红色突出显示一个不对称单位(ASU)(左),从病毒体外部(中间)和内部(右侧)观察,HAdV-F4​​1原子模型的ASU的表面表示。

肠溶性HAdVs已适应了与其他AdVs不同的组织嗜性,这可能反映在其衣壳结构中。一个主要的已知差异是肠溶性HAdV包含两种不同类型的纤维蛋白,长和短(23, 24),而其他AdV仅包含一种类型的纤维。病毒粒子通过与细胞受体的纤维相互作用而停靠在细胞上,然后通过PB与细胞整联蛋白的相互作用介导的内在化作用(25)。 HAdV-F4​​1长纤维与柯萨奇病毒和AdV受体结合(26),但尚未确定短纤维的结合伙伴。短纤维-肠道HAdV的结构特征-有助于抵抗肠道HAdV的低pH(27)。所有其他HAdV在PB中均包含一个与整合素相互作用的Arg-Gly-Asp(RGD)保守基序(28)。值得注意的是,肠溶性HAdV-F4​​0和HAdV-F4​​1缺少这种保守的RGD基序,因此使用不同的整合素进入(29),这可能解释了它们的不同之处,但进入机制却慢得多(30, 31)。有关衣壳蛋白,其结构组织和宿主分子相互作用的知识对于AdV作为载体和疫苗载体的设计和开发非常重要。

尽管肠道AdVs作为腹泻导致儿童死亡的主要原因在医学上具有重要意义,但其感染的结构基础尚不清楚。我们使用低温电子显微镜(cryo-EM)来测定pH 7.4和pH 4.0时HAdV-F4​​1病毒体的近原子结构,后者设置为幼儿胃中日平均pH值(32)。这些结构揭示了衣壳,与非肠溶性HAdV相比,衣壳在胃中的pH值在结构上没有变化,并且表面具有广泛的重塑。我们进一步提出了核心蛋白V的保守位置,该位置将AdV基因组与衣壳连接。最后,我们描述了组装诱导的PB蛋白的结构变化。我们相信,这些发现将为详细了解肠道AdVs,如何预防其感染以及如何进一步探索AdVs作为疫苗开发的载体奠定基础。

结果

HAdV-F4​​1的结构显示衣壳表面电荷分布发生变化,在结构上不受低pH值的影响

为了阐明肠道AdV感染的结构基础,我们使用了冷冻电磁场测定了HAdV-F4​​1的结构。同时,对纯化病毒(“ Tak”株)的基因组进行了测序,与同一个菌株(GenBank: DQ315364.2)。此外,使用高回收率过滤辅助样品制备(FASP)质谱(MS)确定了其蛋白质组(33),揭示了纯化的病毒中共有22种病毒蛋白(表S1)。在平均分辨率为3.8Å的情况下,HAdV-F4​​1的三维(3D)重建具有连续的电子密度,具有明确定义的二级结构元素和侧链密度(图S1和电影S1)。本地分辨率估计表明,二十面体衣壳的大部分分辨率都优于3Å(图S1)。这使我们能够建立和完善不对称单元(ASU)的原子模型,该模型描述了病毒的二十面体部分(图1B 和电影S2)。最终的ASU模型包含四个六邻体同三聚体,PB蛋白和IIIa的单链(图S2),VI的10个链,VIII的两个链(图S2),triskelion蛋白IX的四个链和VIIs的五个链。未知身份,确认已知和揭示未知的蛋白质-蛋白质相互作用表面(表S2)。纤维的电子密度存在于与二十面体衣壳的界面处,但由于远端部分的柔韧性增加,因此无法用于广泛的模型构建。与其他两种报道的HAdV的结构相比,HAdV-C5 [蛋白质数据库(PDB):6B1T(20)]和HAdV-D26 [PDB:5TX1(21)],衣壳蛋白的序列同一性范围为30%至80%(表S3)。这通常与三个结构之间的平均结构相似性相关,差异更大的蛋白质在Cα均方根偏差(RMSD)方面显示出更高的结构差异(表S3)。

在适应胃肠道嗜性时,肠内AdVs的主要障碍可能是通过低pH值的胃到达其肠道感染部位。为了研究对胃中不利环境的适应性,我们解决了pH 4.0时HAdV-F4​​1的结构,该结构类似于幼儿的每日平均胃pH(图2A )( 32)。在达到5.0Å的分辨率下,衣壳在pH 4.0时的总体结构基本保持不变(对于列于此处的蛋白质,总CαRMSD为3.0Å) 图2B),没有观察到明显的局部运动(图2B),表明HAdV-F4​​1衣壳的二十面体部分(不包括纤维)在胃pH值下没有任何大的构象变化。我们认为胃肠适应可能改变了衣壳外表面暴露的酸性和碱性残基的分布。为了对此进行研究,计算出pH 7.4时HAdV-F4​​1以及其他两个现有HAdV结构(HAdV-C5和HAdV-D26)的表面电荷分布。目视比较电荷分布,发现三种HAdV之间存在显着差异(图2C)。 HAdV-D26的裸露表面在pH 7.4时几乎完全被负电荷覆盖,而HAdV-C5在六边形的顶部大部分带负电荷[在计算中,由于排除了柔性材料,因此低估了负电荷的数量,以及带负电的高变区1(HVR1;图2D),该区未建在任何HAdV-C5结构中( 19, 20, 3437)]。相比之下,HAdV-F4​​1的衣壳主要在pH 7.4时不带电荷,尤其是在六邻体塔和PB蛋白的顶部(图2C)。 HAdV-F4​​1在pH 4.0下的表面电荷分布显示出两个不同的区域,在此极端pH下仍相对不带电:IX的N端部分(大部分被六邻体之间封闭)和溶剂暴露的环在六邻体的顶部( 图2C )。

Fig. 2 pH 7.4和pH 4.0时HAdV-F4​​1的结构和表面电荷分布。

(A)HAdV-F4​​1在pH 7.4和pH 4.0时电子密度的表面表示,以距病毒体中心的距离着色。 (B)通过RMSD在Cα水平测量,选定的HAdV-F4​​1衣壳蛋白的pH依赖性结构变化。 (C)HAdV-C5(PDB:6CGV),HAdV-D26(PDB:5TX1)和HAdV-F4​​1(pH 7.4)以及HAdV-F4​​1(pH 4.0)的原子模型的表面电荷分布。红色代表局部净负电荷,蓝色代表正电荷,白色代表不带电。 (D)比较HAdV-C5,HAdV-D26,HAdV-F4​​0和HAdV-F4​​1之间的HVR1序列。 (E)HAdV-C5和HAdV-F4​​1的包含HVR1的循环的卡通表示。 HAdV-C5的未建环路显示为虚线。

六邻体链的整体结构折叠在AdV之间是保守的,但在七个HVR中却有所不同。将HAdV-F4​​1(在pH 7.4下)与HAdV-C5和HAdV-D26进行比较,发现所有七个HVR均存在显着差异(图S3和表S4)。特别是HVR1在比较中脱颖而出,因为它在肠道HAdV中要短得多(图2D)。尚未在任何报道的HAdV-C5结构中建立带负电的HVR1回路(11, 20),表示其灵活性。另一方面,HAdV-F4​​1中较短的HVR1形成具有刚性构象的环,从而可以追踪多肽的全长(图2E )。

总而言之,这些发现表明,与非肠溶性HAdV相比,HAdV-F4​​1衣壳的二十面体部分在结构上不受胃样pH的影响而被扰动,并且其外表面带电残基的暴露也越来越少。删除HVR1。

IX蛋白以独特的方式排列在HAdV-F4​​1中

在所谓的次要衣壳蛋白中,IX形成了最广泛和最复杂的排列。在先前报道的HAdV-C5和HAdV-D26结构中,这相当于紧密的有序蛋白质密度网格,延伸穿过六邻体之间遍及病毒粒子表面的峡谷(图3A )( 11, 21, 38)。在HAdV-F4​​1中,只有N端残基1至58(以下称为“ IX-N”)被充分排序以追踪蛋白质链,因此排除了在其他HAdV中看到的相同类型的有序,跨病毒的IX笼子(图3A)。为了进一步研究IX的C端位于HAdV-C5和HAdV-D26中是否存在任何有序的蛋白质密度,我们在此位置进行了局部不对称3D分类(39)。 3D类均未显示任何与IX在此位置的其他HAdV中形成的四螺旋束相对应的任何有序蛋白密度(图S4)。与其他HAdV相似,IX-N会三聚形成三尖峰(图3B)位于三个非腹膜六邻体单元(图1B)。病毒体的每个小面在两个不同的结构环境中包含四份IX-N triskelion:在每个ASU的局部三重对称轴处为三个副本,在小面中心为二十面体三倍对称轴处为一个副本(图S5) 。这两个环境中IX-N的构型实际上是相同的(图3B)。三个IX链在此triskelion的中心汇合在一起,残基Phe之间相互作用12,苯丙氨酸17和Tyr20 每个链上形成一个疏水核图3C)。与非肠溶性HAdV-C5和HAdV-D26(图S5)相比,该疏水性核心的排列方式不同,并且在其中心具有更大的疏水性残基。

Fig. 3 形成三萜的蛋白质IX以独特的方式在HAdV-F4​​1中组装。

(A)HAdV-D26和HAdV-F4​​1中IX装配体的表面表示,包括所有有序的蛋白质密度。 (B)HAdV-F4​​1 IX-N triskelion组件的图形表示。三个IX链原子(绿色,灰色和紫色)​​以棒状表示形式显示,并被半透明表面覆盖。 (C)由残基Phe形成的IX triskelion组件中心的疏水核的特写视图12,苯丙氨酸17和Tyr20 每个IX链。 (D)通过HAdV-F4​​1在pH 7.4的电子密度在局部三倍轴上IX位置的计算切片。电子密度为白色,但建议的IX-C密度为绿色。 ( E)与(D)相同,但在二十面体三重轴处。 (F)IX-C的一种可能布置的示意图。

HAdV-C5,HAdV-D26和HAdV-F4​​1蛋白IX的序列比较显示,它们各自的IX-N具有比IX的C端部分更高的序列同源性(残基59至133;“ IX-C”)(图S5)。但是,HAdV-F4​​1和相关的HAdV-F4​​0中IX-C的序列几乎相同,表明在肠溶性AdV之间是保守的。 MS分析检测到纯化的HAdV-F4​​1中的整个IX序列,从而证实了纯化的病毒体中存在IX-C(表S1)。我们认为,发自六邻体之间狭窄空间的,相当于IX-C的大量蛋白质,即使在柔韧性上也应在较低的阈值下在电子密度图中可见。实际上,IX-N上方的六面体空间具有电子密度,对应于局部三倍轴上的柔性蛋白质(图3D 和无花果。 S5和S6)。该密度似乎传递到了周围三个六边形的HVR2循环之间的衣壳外部。在局部不对称重建中,三个HVR2可以整体解析,表明它们以单一构型存在,并形成一定大小的缩颈(图S6),该密度从中突出。相反,在二十面体三重位置,IX-N上方显然没有电子密度( 图3E 和图。 S4),这表明IX-C的空间组织在这两个位置之间有所不同(图3F)。在IX的C末端位于HAdV-C5和HAdV-D26的位置附近,代表15%位置的一小类具有较弱的密度,有点类似于局部三倍轴上的突出密度(图S4)。

总之,这些数据表明,与呼吸道(C5)和眼部(D26)HAdV相比,IX在肠道AdV中的排列方式非常不同。在HAdV-F4​​1中,IX的C端一半很灵活,并且似乎在每个病毒体小平面上四个IX位置中的三个IX的C末端暴露于衣壳外部。

HAdV-F4​​1 PB经历组装诱导的构象变化

PB蛋白位于AdV衣壳的五个对称轴上,形成一个含有整合素结合基序的同戊二烯,并充当将二十面体衣壳与纤维连接的装配中心(图1A)。在我们对整个HAdV-F4​​1的重建中,与衣壳的其他部分相比,PB的电子密度分辨不佳。为了改善PB的图谱,我们对PB单体进行了局部不对称重建(图S7)。改进后的地图允许为PB建立一个原子模型,并将其放入整个ASU的复合原子模型中。总体而言,HAdV-F4​​1 PB与HAdV-C5中的PB非常相似(11, 12, 20)和HAdV-D26(21),具有丰富的β折叠褶皱,可以将其大致分为四个区域:冠,头,身体和尾巴,身体和头部为主要区域,并由环区域隔开(图4A )。

Fig. 4 HAdV-F4​​1 PB经历组装诱导的构象变化。

(A)病毒体结合的PB(vPB)的卡通表示形式,可分为冠,头,身体和尾巴。 (B)免费PB(fPB)的卡通表示。 (C) Cartoon representation of the vPB 和 a single vPB monomer chain, each colored by CαRMSD指示C的局部差异程度α positioning between the vPB 和 fPB structures. (D)单个vPB单体链的卡通表示(灰色)。 fPB结构中缺失的残基以红色突出显示。 (E)包含位于冠中的整联蛋白结合IGDD图案(虚线)的螺旋线和无序环区域的卡通表示。电子密度显示为透明表面。

在病毒颗粒组装过程中,PB与戊四烯六邻体,纤维和IIIa形成大量相互作用(表S2)。为了研究PB组装过程中诱导的构象变化,我们通过冷冻-EM解决了溶液[游离PB(fPB)]中重组表达的HAdV-F4​​1 PB的结构。该地图的平均分辨率为3.7Å(图S8),可以放置原子模型(图4B)。比较fPB和与病毒体结合的PB(vPB)的原子模型,总体Cα位移(RMSD)非常小(〜0.9Å)。然而,通过vPB与fPB的结构差异对vPB进行颜色编码后发现具有较高RMSD的区域,表明局部装配诱导的构象变化(图4C 和电影S3)。此外,无法在fPB模型中建立vPB模型中建立的四个序列段(图4A),表明这些区域在溶液中是无序的,并且仅在组装到病毒体中后才稳定在定义的构象中。一个这样的区域是尾巴,一个17残基(Thr33 -甘氨酸 49)随机线圈区域(图4A),在fPB(图4B)。通过与来自IIIa的两个环区域(表S2)的相互作用使其稳定。在HAdV之间尾部结构域的序列在很大程度上是保守的(图S9),表明作为装配基序的保守作用。第二个主题(提尔419 -吕 429)在组装时成为有序的是由残基Gln组成的α螺旋416 -小时 427,位于PB的五倍轴附近(图4D)并靠近纤维束缚的位置。尽管HAdV-F4​​1衣壳图显示与PB相连的近端纤维仅具有较弱的密度,但vPB结构确实可以追踪到保守的纤维尾部的片段(图S9和表S2)。因此,Gln的折叠416 -小时 427 取决于衣壳内的相互作用和/或纤维与PB的结合。依赖于装配的其他相互作用在残基Val之间的两个环区域中发生70 -阿森 110 在身体领域(图4D)。这些环在fPB中是无序的,但在vPB中已得到很好的解决,在vPB中,其构象通过与戊四烯六邻体的相互作用而得以稳定。第一次循环(Ser74 -Ser 79)(位于主体顶部)在与六邻体链Ser相互作用时稳定为扩展的线圈结构663 -Tyr 671 循环。第二区域(Thr100 甘氨酸 107)位于身体底部,在结合到由戊四烯六邻体残基Ala形成的不带电荷的口袋时,稳定为短α螺旋623 -Ile 640.

对于肠型HAdVs而言,特异的是,原本保守的整联蛋白结合RGD基序已被HAdV-F4​​1中的Ile-Gly-Asp-Asp(IGDD)取代[对于HAdV-F4​​0,则为Arg-Gly-Ala-Asp(RGAD)]。在HAdV-F4​​1结构中,含IGDD的环是PB中唯一没有连续电子密度的表面暴露部分(图4E),尽管比大多数其他HAdV短(图S9)(28)。这与先前报道的两个HAdVs结构中RGD基序的观察到的柔性相似(1921),表明IGDD序列的功能可能取决于它在与靶分子相互作用之前是否具有柔性。

总之,溶液中和病毒衣壳中PB的比较显示了几个不同的基序,这些基序仅在PB组装到衣壳中时才折叠,并且进一步揭示了非经典的整联蛋白结合基序IGDD在这种情况下也是无序的。组装病毒。

DNA结合蛋白V位于衣壳内表面的保守位置。

在pH 7.4初步构建病毒体模型后,ASU包含5条仍未分配身份的肽链。五个链中的四个被认为太短,无法为其分配身份。这四个链中的三个在衣壳内表面VI与VIII或IIIa相互作用的位置与VI的不同副本交织(图S10和电影S2)。第五条未鉴定的肽链明显更长,位于衣壳的内表面,位于三个非腹膜六邻体形成的口袋中(图5,A和B,以及表S5)。它的电子密度可以很好地分辨以识别大的侧链残基,因此我们认为可以设计结构生物信息学工作流程来揭示其身份。最初的限制只是确定的24-mer肽中的4和21号残基必须具有较大的侧链,因此我们结合了蛋白质组学数据,排除了具有已知位置的蛋白质,真实空间精制分数以及其他考虑因素阐明其身份(请参阅补充方法和补充材料中的图S11)。根据这些标准依次排除候选物后,剩下了一个最可能的候选物,即从蛋白质V:Gln中心开始的序列 170-Asp194。据报道,V直接与DNA和VI结合,从而桥接核心和周围的衣壳,但是它尚未被定位在任何AdV结构中。构建的V序列适合密度,没有任何碰撞或与周围蛋白质的不太可能的相互作用,而且在HAdV-C5和HAdV-D26中显示了V高度的序列保守性(图5,C和D,以及电影S4)。在迄今为止发布的两个HAdV结构中,HAdV-C5(20)和HAdV-D26(21),病毒衣壳(图5E)。在HAdV-C5中,没有内置原子模型(20)。同样,在HAdV-D26结构中的相应位置,放置了两条较短的身份未知的较短肽链(21)。 V的24-mer链的位置使得在我们的结构中未解析的V的N和C末端都可能向病毒体内部突出,这与V提议的连接病毒的作用一致衣壳的基因组。总之,我们使用了系统的结构生物信息学方法来提出核心蛋白V在HAdV中的可能保守的位置。

Fig. 5 DNA结合蛋白V在三个非腹膜六邻体亚基的界面处的位置。

(A)V电子密度的表面表示。箭头指示在生物信息学分析过程中固定的位置。 (B)V的示意图及其在HAdV-F4​​1 ASU中的位置。 (C)从HAdV-C5,HAdV-D26,HAdV-F4​​0和HAdV-F4​​1鉴定的V氨基酸序列的比对。着色表示序列同一性百分比,深蓝色表示100%同源性。 (D)建模的HAdV-F4​​1 V肽的图形表示,以栗色显示,棒状表示被相应的电子密度覆盖,以透明表面显示。 (E)HAdV-C5 [EMD-7034(20)]和HAdV-D26 [EMD-8471(21)]电子密度位于各自ASU中的相同位置。

讨论

在这里,我们介绍幼儿腹泻和与腹泻相关的死亡率的主要原因:肠腺病毒HAdVF41。作为具有明显胃肠道嗜性的AdV的第一个结构,它揭示了一个衣壳,其结构实际上不受胃pH值的影响,并且与呼吸道和眼用HAdV相比,其病毒颗粒表面也发生了实质性变化。总体而言,HAdV-F4​​1在其衣壳表面暴露的带电残基(即pH依赖性)较少。这在HVR1长且富含HAdV-C5中带负电荷的残基的六邻体顶部尤为突出。这允许HAdV-C5与乳铁蛋白通过电荷依赖性机制相互作用(40),这有助于延长组织的向性性(41, 42)。 HAdV-F4​​1的进化导致截短的HVR1电荷减少(图2D),貌似能适应胃肠道的特定条件。请注意,我们的研究无法解决肠道AdV的一个主要区别特征:两种不同纤维的存在(图1A)。纤维太柔韧性而不能在当前结构中更大程度地分解,因此,例如,纤维在胃pH下的构象变化可能比本文讨论的病毒衣壳的二十面体部分更大。

HAdV-F4​​1衣壳外部的另一个主要变化是蛋白质IX的构象截然不同。 IX(IX-C)的C端半部是柔性的,而不是形成覆盖病毒的刚性网。一个未知的密度突出到衣壳的外部,正好位于IX-N triskelia上方,并由含六邻体HVR2的环固定在适当的位置。我们赞成这样的解释,即该密度为IX-C,因为它接近IX-N三轮草,通过MS确定了纯化病毒中IX-C的存在,并且因为在IX-C的任何其他位置都找不到IX-C。病毒结构。值得注意的是,在所有IX-N三聚体上都观察到了这种假定的IX-C密度,除了在二十面体三重轴(图3,D和E和无花果。 S4和S5)。在该密度属于IX-C的模型中,每个IX-C链可以顺式出现(即,在它所属的同一个IX-N三聚体之上),也可以在整个病毒体表面伸展以出现在另一个IX之上。 -N三聚体(反式排列)。 HAdV-F4​​1中IX-C的长度与这两种安排均兼容。在某些非HAdV中,所有IX-C的顺式排列都会让人联想到IX,其中IX-C的构象也更加明确(38, 43, 44)。尽管我们的数据不允许追踪IX-C的各个链,但在二十面体三倍的IX-N三聚体之上明显缺乏IX-C密度的明显缺陷排除了IX-C的这种纯顺式排列。一种可能的简化解释是中央IX三聚体采用反式排列,在局部三倍位置向三个IX三聚体的每一个捐赠一条IX-C链,从而使它们的IX-C顺式(图3F)。尽管其他用于IX-C安排的模型可能与我们的数据相符,但从数据中可以清楚地看出,与迄今研究的其他HAdV相比,IX在肠道AdV中以独特的方式安排。对HAdV-F4​​1病毒体表面的所有这些修饰可能与该病毒在整个胃肠道中遇到的不同的相互作用物集和不同的pH范围有关。其他胃肠道病毒与胆汁(杯状病毒)等成分相互作用(45)和脂多糖[脊髓灰质炎病毒(46),小鼠乳腺肿瘤病毒(47)],这对于感染这些病毒至关重要。除了HAdV-F4​​1与胃肠道磷脂的低pH抗性相互作用外(48),对HAdV-F4​​1:胃肠道相互作用组了解甚少。找到例如无序和暴露的IX-C区域的这些相互作用伙伴,将对肠道AdV的感染周期和嗜性产生进一步的了解。

我们的研究进一步揭示了HAdV-F4​​1 PB中的几个基序如何在溶液中无序并且仅在组装到病毒衣壳中时才采用已定义的构象,这为AdV组装的一大难题仍未完成10)。观察到HAdV-F4​​1 PB的修饰的整合素相互作用基序在组装的病毒颗粒中仍然无序,这凸显了对与其拟议的结合伴侣层粘连蛋白结合整合素(29 )。

生化数据已将核心蛋白V定义为将AdV基因组与衣壳连接的关键蛋白(49),但是,尽管它在AdV中具有保守的功能,但它并未位于AdV衣壳中。在这里,我们提出了V与衣壳内部相互作用的点,并提供了数据,表明在三个非腹膜六邻体之间的交界处,该位置在HAdV之间是保守的。以前的生化数据并未表明V与六邻体相互作用,而是表明V与次要蛋白VI之间存在相互作用(49, 50)。这些数据与我们对六邻体的V锚定点的识别不是互斥的,因为大多数V序列在结构中仍未说明,并且在锚定点附近发现了多个VI副本,它们可能形成额外的互动。

肠道AdV HAdV-F4​​1的结构共同揭示了AdV结构的关键保守方面和肠道AdVs的高度不同特征,从而为开发有效抗病毒药的基于结构的方法奠定了基础,从而防止了腹泻相关死亡率的这一突出原因并进一步发展这些结构上不同的AdV类型作为疫苗载体。

材料和方法

病毒繁殖与纯化

将人A549细胞(A. 基德 的礼物)保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM; Sigma-Aldrich)中,该培养基中添加了5%胎牛血清(FBS; HyClone,GE Healthcare),20 mM Hepes(Sigma-Aldrich)和青霉素(20 U / ml)和链霉素(20μg/ ml)(Gibco)。

为了传播HAdV-F4​​1(Tak株),需装30瓶A549细胞(175厘米)2(在90%汇合时)在37℃的摇床上用5 ml生长培养基(1%FBS)中的HAdV-F4​​1接种材料(在A549细胞中产生)感染90分钟。此后,向每个烧瓶中加入另外的25ml生长培养基(1%FBS),并将细胞在37℃下进一步温育。大约1周后或当细胞显示出明显的细胞病变作用迹象时,收集感染的细胞。通过离心收集细胞,将其重悬于DMEM中,并通过冻融和加入等体积的Vertrel XF(Sigma-Aldrich)而破坏以释放病毒体。剧烈重悬后,将细胞提取物以3000 rpm离心10分钟。在20 mM tris-HCl(pH 8.0)中,将上层相转移到不连续的CsCl梯度中[密度:1.27、1.32和1.37 g / ml]; [Sigma-Aldrich],然后在Beckman SW40转子中以25,000 rpm的转速在4°C下离心2.5小时。收集病毒体带,并在NAP柱(GE Healthcare)上脱盐至无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

通过MS进行蛋白质鉴定

蛋白质消化. 将样品分开进行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化,并使用改良的FASP(33)。简而言之,加入三乙碳酸氢铵(TEAB)的终浓度为50 mM TEAB,然后在56°C使用100 mM二硫苏糖醇还原30分钟。将还原后的样品上样至颇尔Nanosep离心过滤器(Sigma-Aldrich)的10 kDa分子量截止值,用8 M尿素和1%脱氧胆酸钠(SDC)洗涤,并用10 mM甲烷硫代磺酸甲酯烷基化。使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作为消化酶,在50 mM TEAB和0.5%SDC缓冲液中,对滤膜进行两步消化。第一步进行过夜,第二步与另外一部分蛋白酶一起在第二天进行4小时。使用Pierce MS级胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)在37°C进行胰蛋白酶消化。在室温下使用Pierce MS级胰凝乳蛋白酶(Thermo Fisher Scientific)进行胰胰蛋白酶消化。通过离心收集肽,并通过用三氟乙酸酸化样品(最终浓度为1%)沉淀SDC。消化后的样品根据制造商的规程使用皮尔斯肽脱盐旋转柱(Thermo Fisher Scientific)进行脱盐。

液相色谱-串联质谱. 使用QExactive HF质谱仪和Easy-nLC 1200液相色谱系统(均采用Thermo Fisher Scientific)对已消化和脱盐的样品进行分析。将肽捕获在Acclaim PepMap 100 C18捕获柱上(100μmx 2 cm;粒径5μm; Thermo Fischer Scientific)并在内部填充的分析柱上分离(75μmx 300 mm;粒径3μm ; Reprosil-Pur C18,Maisch博士)。所用的阶梯式梯度是在97分钟内从7%到35%的溶剂B,然后在8分钟内以300 nl / min的流量增加到48%,在5分钟内增加到100%的溶剂B。溶剂A为0.2%甲酸,溶剂B为80%乙腈的0.2%甲酸溶液。质谱仪以数据相关采集(DDA)模式运行,其中MS1扫描以60,000的分辨率和400至1600质荷比的扫描范围( m / z )。隔离状态为1.2的10个离子强度为2至4的最强离子被隔离 m / z 并使用28的归一化碰撞能量进行碎片化。以30,000的分辨率获取MS2扫描,动态排除时间设置为20 s。

数据库搜索. 使用Proteome Discoverer(1.4版,Thermo Fisher Scientific)进行数据分析。在包含HAdV-F4​​1氨基酸序列的内部数据库中搜索数据。 Mascot(2.5.1版,Matrix 科学)用作搜索引擎,其MS1质谱的前体质量公差为百万分之五,而MS2光谱的质量前体公差为30毫质量单位(mmu)。接受胰蛋白酶消化的肽,最多有1个缺失的切割,而接受胰胰胰蛋白酶消化的肽,最多有3个缺失的切割。选择了蛋氨酸氧化的可变修饰和半胱氨酸的固定甲硫基。肽的吉祥物显着性阈值设置为0.01。

冷冻EM样品制备

纯化的HAdV-F4​​1的使用浓度为4.2 mg / ml(pH 7.4)和1.6 mg / ml(pH 4.0)。如前所述纯化重组HAdV-F4​​1 PB(fPB)(29),并在PBS缓冲液中以1 mg / ml的浓度使用,并补充5%甘油。通过添加2μl0.5 M柠檬酸/ 1 M Na制备pH 4.0的HAdV-F4​​1样品2 高压氧 4 (pH 3.4)溶液加入25μlHAdV-F4​​1(pH 7.4),然后在冰上孵育15分钟。将样品分别在QUANTIFOIL Cu R200 2/2(电子显微镜科学,目录号Q2100CR2)和QUANTIFOIL Cu R200 1.2 / 1.3(电子显微镜科学,目录号Q3100CR1.3)网格上分别进行病毒颗粒和重组蛋白的玻璃化处理。 。在施加样品之前,使用PELCO easiGlow设备(Ted Pella Inc.)以15 mA的辉度将格栅放电30 s。通过使用Vitrobot浸入式冷冻机(Thermo Fisher Scientific)将3μl样品转移到网格的辉光放电面上,吸干并在液体乙烷中浸入,进行以下设置:22°C,80湿度%,吸墨力为-20,吸墨时间为3 s。对于pH 7.4的HAdV-F4​​1,在两次应用之间,使用与上述相同的设置,通过吸墨步骤将样品应用两次( 51 )。

数据采集

所有数据均在FEI Titan Krios透射电子显微镜(Thermo Fisher Scientific)上以300 keV运行,并配有Gatan BioQuantum能量过滤器和K2直接电子检测器。选择70μm的冷凝器孔径(pH 7.4和pH 4.0的HAdV-F4​​1)和100μm的物镜孔径进行数据收集。选择PB41数据收集的C2孔径为100μm。使用AutoCtf / Sherpa进行无昏迷的比对。使用EPU(Thermo Fisher Scientific)软件在平行照明模式下以标称放大倍数130,000×(1.041-Å像素大小)获取数据。以超分辨率模式收集pH 7.4的HAdV-F4​​1结构的两个数据集。由于PB41的首选方向,因此在30°倾斜的阶段收集了第二个数据集。数据收集参数在表S6中列出。

pH 7.4时的数据处理和结构确定HAdV-F4​​1

在pH 7.4的HAdV-F4​​1上收集了两个数据集,并分别进行了独立处理。最初使用RELION 3.0处理数据(52),并在RELION 3.1(测试版)中继续(53)。使用RELION的MotionCor2(54)实施,在此步骤中将超分辨率电影装仓一次,并使用GCTF软件估算每张显微图像的对比度传递函数(CTF)(55)的所有数据集。手工挑选颗粒并进行无参考的2D分类,并通过使用二十面体对称[I3根据Crowther(56)]和衣壳结构的遮罩。低通量(50Å)过滤的HAdV-C5 [EMD-7034(20)]用作参考体积。粒子分为两类,导致将99%的粒子分配到一个分辨率良好的类别中,用于下游处理。使用3D分类的输出作为参考模型进行3D细化,将其低通滤波到50Å,而无需额外的傅立叶填充。细化之后,对数据进行后处理,并对粒子进行每粒子CTF细化,贝叶斯抛光和另一轮每粒子CTF细化。在合并两个数据集并执行最终3D精炼之前,不对这些粒子进行额外的3D精炼,而无需进行额外的Fourier填充。在后处理之后,使用金标准傅里叶壳相关性[FSC阈值,0.143)]到3.84Å计算分辨率。最后,使用RELION对数据进行了埃瓦尔德球体曲率的校正,这导致了电子密度图的局部改善,新的平均分辨率为3.77Å。使用ResMap( 57 )。

使用SWISS-MODEL服务器生成同源模型(58),HAdV-F4​​1衣壳蛋白序列,已在结构上确定了其同源物。产生的同源性模型基于已报道的HAdV-D26结构[PDB:5TX1(21)]。将该模型手动对接至ChimeraX中的HAdV-F4​​1电子密度(59),并提取与ASU对应的地图。使用Phenix的(60)自动锐化工具。随后,将HAdV-F4​​1同源性模型对接,并使用Phenix对其进行初始轮次的实际空间优化。通过使用Phenix进行的实际空间优化和在Coot(61 )。

局部非对称重建

为了改善PB单体周围的图谱质量,需要包含HVR2环的区域(局部三重轴),二十面体三重轴以及类似于HAdV-C5和HAdV-中四螺旋IX-C束的区域。找到D26,使用Ilca报告的局部非对称重建工作流程对地图进行了改进 。 ( 39),并在Scipion v2.0(62)。在ChimeraX中确定亚粒子的坐标,然后通过应用二十面体对称进行定位,并在Scipion v2.0中提取。随后将子颗粒过滤,以排除不存在于图像平面[-20°,20°]范围内的颗粒。然后将所得的亚粒子进行不对称3D分类。为了增加分类过程中收敛的可能性,不允许更改原点和方向。随后的3D精修产生了PB单体和包含HVR2环的区域的3D重构,分别达到3.0和3.35Å的分辨率。平均分辨率是根据金标准FSC计算得出的(阈值,0.143)。表7给出了包含HVR2的环区域和PB单体的数据处理统计信息。使用Remote 3DFSC Processing Server(63 )。

pH 4.0时HAdV-F4​​1的图像处理和模型构建

如对HAdV-F4​​1所述,在pH 7.4结构下处理数据,直到进行首次3D精修为止。将pH 7.4的HAdV-F4​​1体积低通过滤至10Å,并用作参考。后处理后,使用金标准FSC(阈值,0.143)将分辨率估计为5.0Å。本地分辨率估计值是使用ResMap计算的。使用ChimeraX将HAdV-F4​​1(pH 7.4)模型拟合到重建的HAdV-F4​​1(pH 4.0)密度中,提取ASU,然后使用Phenix对生成的图进行局部锐化。然后使用Namdinator()进一步拟合模型并最小化能量64 )。

数据处理和结构确定重组HAdV-F4​​1 PB

使用RELION 3.1(β)处理HAdV-F4​​1 PB(PB41)数据(未倾斜并倾斜30°),并像HAdV-F4​​1结构一样执行束感应运动校正和CTF估计。使用自动粒子采集器crYOLO(65)使用可用的Phosaurus广义模型。在RELION中对粒子进行了无参考的2D分类,并在相同视图下显示了相当大比例的粒子,表明标本的首选方向。根据0°数据,在cryoSPARC(66)。合并分辨率良好的2D类,并使用相同的参考模型对3D进行细化,就像在3D分类期间将低通滤波到10Å。细化之后,对数据进行后处理,然后对粒子进行每粒子CTF细化,贝叶斯抛光和另一轮每粒子CTF细化,然后再执行最后一轮3D细化。检查最终体积后,发现其中一个轴的分辨率较差(图S8)。因此,我们在倾斜的样品台上收集了数据。由于倾斜阶段的数据收集导致沿图像路径的散焦梯度,因此使用GCTF在粒子提取之后和无参考2D分类之前执行了每粒子CTF细化。如后文所述,执行后续处理步骤,以完成样品台上收集的数据。在后期处理之后,使用金标准FSC(阈值,0.143),平均分辨率估计为3.4Å(未倾斜)和3.7Å(倾斜30°)。本地分辨率估计值是使用ResMap计算的。 3DFSC曲线是使用远程3DFSC处理服务器(63 )。

根据在倾斜工作台上收集的数据生成的PB41体积用于下游模型构建和模型优化。首先使用Namdinator将HAdV-F4​​1 pH 7.4模型的PB单体链拟合到PB41体积中(64)和在Coot中修剪的外围残留物。随后,使用Phenix中的实际空间精炼和Coot中的模型构建的迭代循环来完全构建和精炼模型。

表面电荷分布的计算

HAdV-C5的表面电荷[PDB:6CGV(19)],HAdV-D26 [PDB:5TX1(21)]和HAdV-F4​​1使用PDB2PQR-APBS软件包(67)在pH 7.4和pH 4.0下。

生物信息学工作流程,以确定未知链的蛋白质身份

对于未知链的每个方向,将24聚聚丙氨酸链手动放入各自的密度,并首先使用Coot在实空间精炼。使用作业流水线筛选了序列列表,其中包括Coot中的突变步骤和Phenix中的实际空间优化。可根据要求提供为此目的编写的自定义bash脚本。补充方法中提供了扩展说明。

分子图形和可视化

使用ChimeraX生成蛋白质结构和电子密度的图。

补充材料

有关本文的补充材料,请访问: http://advances.cqonlead.com/cgi/content/full/7/2/eabe0974/DC1

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这是根据以下条款分发的开放获取文章 知识共享署名-非商业许可,它允许在任何介质中使用,分发和复制,只要最终的使用是 出于商业利益,并提供了适当引用的原始作品。

参考和注释

致谢: 我们非常感谢P. 埃姆斯利提供的Coot脚本帮助,M. Hall提供的cryoSPARC帮助以及T. 特威利格的帮助提供了Phenix。我们感谢S. Nord,J。Näslund和A.Sjödin(FOI,瑞典国防研究所,瑞典于默奥)对DNA测序的帮助。蛋白质鉴定是在哥德堡大学Sahlgrenska学院的蛋白质组学核心设施中进行的。 资金: 我们感谢人类前沿科学计划(L.-AC获得职业发展奖CDA00047 / 2017-C),Stiftelsen Olle EngkvistByggmästare(KR博士后研究金),Knut和Alice Wallenberg基金会(通过Wallenberg Center for分子医学Umeå)和瑞典研究委员会(Dnr 2019-01472和2017-00859)。 Cryo-EM数据在Umeå电子显微镜核心设施(SciLifeLab国家Cryo-EM设施和国家显微镜基础设施的一部分,NMI VR-RFI 2016-00968)中收集,并得到了Knut和Alice Wallenberg基金会以及肯普基金会。我们感谢于默奥大学北部的高性能计算中心(HPC2N)在测试和性能运行期间提供了计算资源和宝贵的支持(SNIC项目2018 / 5-158、2019 / 3-668和2019 / 5-76)。 作者贡献: K. R.,AL.L.,N.A。和L.-A.C.构思并设计了研究。 一种。 L. 生产和纯化的病毒颗粒。 一种。 R.纯化的重组PB蛋白。 K. R.收集cryo-EM数据并执行图像处理,模型构建和验证。 K. R.,AL.L.,N.A。和L.-A.C.解释的结构数据。 J. F。 进行了蛋白质组学分析。 K. R.,A.L.,N.A。和L.-A.C在J.F的帮助下撰写了原始手稿。所有作者均审阅并批准了最终手稿。 利益争夺: 作者宣称他们没有竞争利益。 数据和材料可用性: 可根据要求提供用于生物信息学分析的脚本。这项研究中报告的坐标已保存在PDB中,登录号为6Z7N(HAdV-F4​​1 ASU)和6Z7Q [HAdV-F4​​1(free)PB]。电子显微镜图和半图已保存在电子显微镜数据库中,登录号为EMD-11108(pH 7.4的HAdV-F4​​1),EMD-11111(pH 4.0的HAdV-F4​​1),EMD-11112 [HAdV-F4​​1 (免费)PB],EMD-11109(HAdV-F4​​1 PB的局部不对称重建)和EMD-11110(HAdV-F4​​1 HVR2含环的局部不对称重建)。
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