研究文章病毒学

TRIM26是HCV复制的关键宿主因子,并有助于宿主嗜性

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科学进步 2021年年1月8日:
卷7号2,eabd9732
DOI:10.1126 / sciadv.abd9732
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抽象

丙型肝炎病毒(HCV)仍然是主要的人类病原体,需要更好地了解病毒与宿主之间的相互作用。在这项研究中,我们进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选,并将E3连接酶TRIM26确定为关键的HCV宿主因子。 TRIM26的缺乏会特别损害HCV基因组的复制。机理研究表明,TRIM26与HCV编码的NS5B蛋白相互作用,并在残基K51处介导K27连接的泛素化,从而促进了NS5B-NS5A相互作用。此外,小鼠TRIM26不支持HCV复制,因为其独特的六氨基酸插入物阻止了它与NS5B的相互作用。人TRIM26在已被其他必需HCV宿主因子重构的小鼠肝癌细胞系中的异位表达促进了HCV感染。总之,我们确定TRIM26是HCV复制的宿主因子,也是宿主嗜性的新决定因素。这些结果阐明了HCV与宿主的相互作用,并可能促进HCV动物模型的发展。

介绍

丙型肝炎病毒(HCV)是属于黄病毒科的一种有包膜的单链RNA病毒。 HCV 核糖核酸基因组的长度为9.6 kb,由一个开放阅读框(ORF)和两侧的高度保守的5'和3'非翻译区(UTR)组成。 ORF编码超过3000个氨基酸的单个多蛋白,可被细胞和病毒蛋白酶切割成结构蛋白(核心,E1和E2)和非结构蛋白(p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B) 。 NS5B是一种RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp),与其他非结构蛋白NS3,NS4A,NS4B和NS5A一起形成细胞内膜相关的复制复合物,并催化病毒基因组RNA复制。 HCV感染全球超过7100万人(1)。在此感染人群中,约80%会持续感染,导致严重的肝脏疾病,例如肝硬化和肝细胞癌(HCC)。针对病毒NS3蛋白酶,NS5A和NS5B聚合酶的最新开发的直接作用抗病毒剂(DAA)在治愈HCV患者方面非常有效。但是,由于缺乏HCV疫苗,潜在的耐药突变,DAA治愈的患者严重的肝脏疾病进展以及其他新出现的问题,在全球范围内根除HCV仍然具有挑战性(2)。更好地了解病毒生命周期和病毒-宿主相互作用对于预防和控制HCV感染仍然至关重要。

由人类70多个成员组成的三方基序(TRIM)家族在多个细胞过程中发挥着作用,包括细胞内信号传导,发育,凋亡,蛋白质质量控​​制,先天免疫,自噬和致癌作用(3)。越来越多的研究集中在TRIM家族蛋白在宿主对病毒感染的应答中的作用。 TRIM5α识别逆转录病毒衣壳以诱导核心过早分解,并抑制病毒基因组的逆转录(4, 5)。 TRIM69通过泛化病毒NS3来限制登革热病毒(DENV)复制(6)。 TRIM22和TRIM41通过靶向核蛋白降解来抑制甲型流感病毒的感染(7, 8)。 TRIM56通过隔离其基因组RNA抑制Zika病毒(ZIKV)复制(9)。

作为E3连接酶,TRIM26包含N端RING域,B盒域,卷曲螺旋域和C端SPRY域。一项研究表明,TRIM26促进干扰素调节因子3(IRF3)降解,从而抑制干扰素-β(IFN-β)信号传导(10),而另一项研究表明TRIM26促进了TBK1和NEMO激酶之间的相互作用,从而导致IFN信号的激活(11)。在这项研究中,我们通过全基因组CRISPR筛选将TRIM26确定为HCV的关键宿主因子。一项机械研究表明,TRIM26介导NS5B泛素化并增强其与NS5A的相互作用,这对于HCV基因组复制至关重要。此外,我们证明了小鼠TRIM26不支持HCV复制,因为其独特的六氨基酸插入物阻止了它与NS5B的相互作用,为理解HCV感染极窄宿主向性的遗传基础提供了新证据。人TRIM26在已被其他必需的HCV宿主因子重构的小鼠肝癌细胞系中的异位表达促进了HCV感染,为HCV动物模型的发展提供了线索。

结果

鉴定对HCV感染至关重要的宿主因素

利用NIrD(NS3-4A诱导型rtTA介导的双重报告者)报告系统,以实时和活细胞方式监测HCV感染(12),我们进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选,以鉴定对HCV感染至关重要的宿主因子(13)(图1A)。携带NIrD报告基因的Huh7.5细胞在强力霉素作用下感染细胞培养的HCV(HCVcc)后显示红色荧光(mCherry)。用HCVcc以0.1的感染复数(MOI)感染针对人蛋白质编码基因的CRISPR单向导RNA(sgRNA)文库转导的报告细胞,并且通过细胞分选富集mCherry阴性细胞。通过深度测序测量富集的mCherry阴性细胞中每个sgRNA的丰度,并使用RIGER(RNAi基因富集等级)算法进行分析(表S1和S2)。从这次筛选中发现了许多宿主因素(图1B)。在排名靠前的候选基因中,CD81,occludin(OCLN)和claudin 1(CLDN1)是明确定义的HCV进入因子(1416)。肽基脯氨酸异构酶A(PPIA),也称为亲环蛋白A(CypA),已被证明对HCV复制至关重要(17)。 ELAV样RNA结合蛋白1(ELAVL1)与HCV 3'UTR相互作用并增强HCV复制(18)。这些积极的结果证实了我们的CRISPR筛选。除了这些先前介绍的匹配数据外,TRIM26是我们筛查中的热门数据,并且在之前的筛查中也被确定(19)。为了研究TRIM26在HCV感染中的作用,我们通过CRISPR干扰(CRISPRi)沉默了Huh7细胞中TRIM26的表达(20)。二 TRIM26 有效降低TRIM26表达的sgRNA(sg1和sg2)(图1C),对细胞生存力没有影响(图1D),用于以下实验。 TRIM26 用HCVcc以0.1的MOI感染击倒的击倒细胞,并在HCVcc感染后的指定时间点测量细胞内HCV 核糖核酸,NS3蛋白水平和细胞外HCV滴度。如图所示 图1(E到G), TRIM26 组合式降低HCV 核糖核酸水平,NS3蛋白表达和细胞外HCV滴度。我们进一步重建了野生型TRIM26和RING域缺失的突变体(TRIM26ΔR)。 TRIM26 击倒和控制单元。通过Western印迹验证了这些细胞中TRIM26和TRIM26ΔR的表达(图S1A)。如图所示。 S1(B到D)是野生型TRIM26的外源表达,但不是TRIM26ΔR的外源表达,可恢复HCV感染。 TRIM26 击倒细胞。

Fig. 1 鉴定对HCV感染至关重要的宿主因素。

(A)全基因组规模CRISPR筛选的示意图。 (B)在RIGER分析后显示了在CRISPR筛选中确定的命中。筛选中的热门命中标有不同颜色的基因符号。 (C三种蛋白中TRIM26表达的蛋白质印迹分析 TRIM26 击倒Huh7细胞。 (D)的影响 TRIM26 降低细胞活力。 (EG)控制和 TRIM26 在指定的时间点,将敲低的Huh7细胞感染HCVcc,MOI为0.1,确定细胞内HCV 核糖核酸(E),细胞外HCV滴度(F)和NS3蛋白(G)。 HCV 核糖核酸表示为相对于肌动蛋白mRNA水平的值。误差棒代表来自两个独立实验的SD。 FFU,焦点形成单元。单向方差分析用于统计分析。不重要(ns), P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P <0.0001。蛋白质水平通过ImageJ定量,针对内部肌动蛋白标准化,并表示为相对于对照细胞的值。

为了进一步确认TRIM26在HCV感染中的作用,我们产生了Huh7.5.1 TRIM26 敲除细胞(图S2,A和B)。然后,我们感染了Huh7.5.1 TRIM26 HCVcc的MOI为0.1的基因敲除和对照细胞。一致地, TRIM26 敲除可降低HCV 核糖核酸水平,NS3表达和细胞外HCV滴度(图S2,C至E)。总之,这些结果表明,TRIM26在HCV感染中起重要作用。

TRIM26的缺乏会损害HCV基因组复制

先前的研究表明TRIM26参与IFN信号传导(10, 11)。检查IFN信号传导的潜在作用 TRIM26 基因敲低细胞感染HCV,Huh7-TRIM26 用HCVcc感染敲低的和对照细胞,MOI为0.1。通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定IFN-β和IFN-刺激基因(ISG)的mRNA水平。如图所示。 S3,没有观察到差异 TRIM26 HCV感染后基因敲低和控制细胞,提示TRIM26参与HCV感染不是由其对宿主IFN信号传导的潜在作用介导的。

为了研究HCV生命周期TRIM26的哪个步骤,我们使用了HCVΔE1,该病毒在病毒基因组中缺少E1区,只在Huh7细胞中进行了单轮感染( 21)。呵呵7-TRIM26 用HCVΔE1病毒以MOI为0.1感染击倒和对照细胞,并测定HCV 核糖核酸水平。如图所示 图2A, TRIM26 感染后72小时,基因敲低将HCVΔE1RNA水平降低了约7倍,这表明TRIM26可能有助于HCV进入或基因组复制。接下来,我们使用了带有HCV包膜糖蛋白并用作HCV进入替代模型的假型HCV颗粒(HCVpp)(22)。呵呵7-TRIM26 用HCVpp感染击倒细胞和对照细胞。如图所示 图2B,两者之间没有发现实质性差异 TRIM26 基因敲低和控制细胞,表明TRIM26对HCV的进入没有影响。为了评估TRIM26对HCV多蛋白裂解和翻译的潜在影响, TRIM26 用表达非结构蛋白NS3-5B或RdRp缺陷型HCV基因组(JFH1-GND-Rz)的质粒转染基因敲除和对照细胞,该基因概括了内部核糖体进入位点(IRES)依赖的病毒蛋白翻译和多蛋白切割。如图所示。 S4, TRIM26 击倒对HCV多蛋白的切割和翻译没有影响。最后,我们使用HCV亚基因组复制子(作为病毒基因组复制的替代模型)检查了TRIM26对HCV基因组复制的影响(23)。用表达下列基因的慢病毒转导JFH1亚基因组复制子细胞 TRIM26-sgRNA或对照 绿色荧光蛋白-sgRNA。分别通过RT-qPCR和Western blot分析HCV 核糖核酸和NS3蛋白水平。如图所示 图2(C和D), TRIM26 击倒降低了HCV 核糖核酸和NS3蛋白水平。总之,这些结果表明,TRIM26可能与HCV基因组复制有关。

Fig. 2 TRIM26的缺乏会损害HCV基因组的复制。

(A)控制和 TRIM26 在指定的时间点,用单轮传染性HCVΔE1感染击倒的Huh7细胞。通过RT-qPCR检测HCV 核糖核酸水平。 (B)控制和 TRIM26 击倒的Huh7细胞感染了HCVpp。通过荧光素酶测定定量感染性。 (CD在指定的时间点用sgEGFP或sgTRIM26转导JFH1-SGR细胞。 HCV 核糖核酸(C)和NS3蛋白水平(D)分别通过RT-qPCR和Western blot测定。误差棒代表来自两个独立实验的SD。单向方差分析(A和B)和 t 测试(C)用于统计分析。 ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ****P <0.0001。蛋白质水平通过ImageJ进行定量,针对内部肌动蛋白进行标准化,并表示为相对于对照的值。

接下来,我们确定其他HCV基因型的复制是否需要TRIM26。 Con1(基因型1b)(23)和PR87(基因型3a)(24用表达以下基因的慢病毒转导携带亚基因组复制子的细胞 TRIM26-sgRNA或对照 绿色荧光蛋白-sgRNA。如图所示。 S5(A到D), TRIM26 基因敲低降低了Con1和PR87病毒RNA和NS5A蛋白的表达。此外,我们证明了 TRIM26 敲低抑制了另一种基因型2a HCVcc株PR63cc的感染(图S5E)( 25)。总的来说,这些结果表明TRIM26有助于从多种基因型复制HCV。

接下来,我们检查了TRIM26是否在其他黄病毒(如DENV和ZIKV)的感染中起作用。呵呵7-TRIM26 用DENV或ZIKV以0.1的MOI感染击倒的和对照细胞。测量了细胞内病毒RNA(图S6,A和D),细胞外病毒滴度(图S6,B和E)和DENV E蛋白水平(图S6C)。结果表明 TRIM26 击倒对DENV和ZIKV感染没有影响。

TRIM26与HCV NS5B蛋白相互作用

为了阐明TRIM26促进HCV复制的潜在机制,我们确定了TRIM26与HCV编码蛋白的相互作用。将表达TRIM26和FLAG标签的HCV蛋白的质粒共转染到人胚胎肾(HEK)293T细胞中,以进行免疫共沉淀(co-IP)分析。如图所示。 S7(从A到H)和TRIM26与NS5B,而不与核心,E1,E2,NS2,NS3,NS4B或NS5A共免疫沉淀。相反,NS5B与血凝素(HA)标记的TRIM26共免疫沉淀(图3A)。我们通过共聚焦显微镜进一步证实了NS5B和TRIM26的共定位(图S7I)。为了验证在HCV感染的情况下TRIM26-NS5B的相互作用,异位表达FLAG标签的TRIM26的Huh7细胞在MOI为1的情况下被HCVcc感染48小时,并进行了co-IP分析。一致地,NS5B(而非NS3)与TRIM26共免疫沉淀( 图3B)。在JFH1亚基因组复制子细胞中也证实了这种相互作用(图3C)。

Fig. 3 TRIM26与HCV NS5B相互作用并促进其泛素化。

(A用表达HA标签的TRIM26和FLAG标签的NS5B的质粒转染HEK293T细胞。使用抗HA抗体进行co-IP分析。 IB,免疫印迹; IP:免疫沉淀。 (B)将被FLAG标签的TRIM26转染24小时的Huh7细胞再感染HCVcc 48小时,并用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解液。 (C将JFH1亚基因组复制子细胞用FLAG标签的TRIM26转染48小时,然后用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解液。 (D将HEK293T细胞用表达FLAG标签的NS5B,TRIM26或TRIM26ΔR以及HA标签的泛素转染48小时。细胞裂解物用抗FLAG抗体免疫沉淀,并通过所示抗体进行分析。 ( E用表达FLAG标签的NS5B和TRIM26以及HA标签的泛素或泛素突变体的质粒转染HEK293T细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体免疫沉淀,并通过所示抗体进行分析。 (F)用表达FLAG标签的NS5B或NS5B K51R和TRIM26以及HA标签的泛素的质粒转染HEK293T细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体免疫沉淀,并通过所示抗体进行分析。 (G用表达FLAG标签的NS5B或NS5B K51R和TRIM26的质粒转染HEK293T细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体免疫沉淀,并通过所示抗体进行分析。 (H)控制和 TRIM26 使用体外转录的JFH1或JFH1-K51R亚基因组RNA对击倒的Huh7细胞进行电穿孔。选择G418后,收获亚基因组复制子细胞,用于通过RT-qPCR检测HCV 核糖核酸水平。误差棒代表来自两个独立实验的SD。 t 测试用于统计分析。 ns, P > 0.05; **P >0.01。蛋白质水平通过ImageJ定量,针对TRIM26输入蛋白质水平进行标准化,并表示为相对于FLAG IP蛋白质水平的值。

接下来,我们试图映射TRIM26-NS5B交互必不可少的关键域。我们构建了在N末端RING结构域(TRIM26ΔR)或C末端SPRY结构域(TRIM26ΔSPRY)(图S8A)中缺失的TRIM26突变体,以及在N末端指状结构域(NS5BΔN中缺失)的NS5B突变体。 ),中央手掌结构域(NS5BΔ188-371)或C端拇指结构域(NS5BΔC)(图S8B)。 co-IP分析表明,相互作用需要TRIM26的SPRY域和NS5B的C端区域(图S8,A和B)。

TRIM26促进NS5B的泛素化

由于TRIM26在HCV复制中的功能需要其RING域(已知负责泛素化其底物)(图S1,B至D),因此我们接下来检查TRIM26是否介导NS5B泛素化。将HEK293T细胞与表达野生型或RING缺失的TRIM26,带有FLAG标签的NS5B和带有HA标签的泛素一起共转染质粒,然后免疫沉淀NS5B,并通过Western印迹分析其泛素化。如图所示 图3D,野生型,但没有删除RING的TRIM26,促进了NS5B的泛素化。众所周知,泛素会通过其内部赖氨酸残基在6、11、27、29、33、48或63位与底物蛋白连接(26);因此,我们构建了一系列泛素突变体,这些突变体在每个位置上的赖氨酸(K)-精氨酸(R)变化。我们发现具有K27R突变的泛素显着降低了TRIM26介导的NS5B泛素化(图3E),表明K27可能是与NS5B连接的泛素赖氨酸残基。

接下来,我们寻求鉴定TRIM26靶向的NS5B的关键赖氨酸残基。 JFH1的NS5B中有30个赖氨酸残基。我们分析了这些个体赖氨酸残基在不同HCV基因型之间的保守性及其在NS5B(蛋白质数据库ID:2XYM)三维结构中的位置(图S9A)( 27)。鉴于TRIM26参与了HCV基因型1、2和3的复制,我们选择了11个赖氨酸残基,在三种基因型中高度保守(保守,>90%)并位于NS5B结构的表面(图S9A中红色突出显示)。如图所示 图3F 和图。 S9C(NS5B中的K51R突变)显着降低了TRIM26介导的NS5B泛素化,这表明TRIM26促进了K51残基处NS5B的K27连锁泛素化。

接下来,我们调查了NS5B中的K51R突变是否影响其与TRIM26的相互作用。将表达TRIM26和野生型或K51R突变的NS5B的质粒共转染到HEK293T细胞中,以进行co-IP实验。如图所示 图3G,K51R突变并不损害NS5B和TRIM26之间的相互作用。

最后,我们评估了K51R突变对HCV复制的影响。在野生型和野生型中建立了野生型或NS5B-K51R突变体JFH1亚基因组复制子。 TRIM26 击倒Huh7细胞。如图所示 图3H,NS5B K51R突变降低了野生型细胞中的HCV复制,但没有降低 TRIM26 击倒细胞。总之,这些结果表明,在K51残基处TRIM26介导的NS5B泛素化对于HCV复制至关重要。

TRIM26增强了NS5B和NS5A之间的相互作用

为了研究TRIM26介导的NS5B泛素化如何增强HCV复制,我们检查了NS5B与参与病毒复制复合体的其他非结构蛋白的相互作用。呵呵7-TRIM26 用表达NS3-5B多蛋白的质粒转染击倒和对照细胞。如图所示 图4A, TRIM26 组合式降低了NS5B和NS5A之间的相互作用,但对NS5B和NS3之间的相互作用影响很小。一致地,TRIM26过表达特别增强了NS5B和NS5A之间的相互作用(图4,B和C)。

Fig. 4 TRIM26促进NS5B和NS5A之间的相互作用。

(A)控制和 TRIM26-用表达NS3-5B-3×FLAG的质粒转染击倒的Huh7细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀,然后用所示抗体进行免疫印迹。 (BC用表达FLAG标签的NS5B,TRIM26和NS3(B)或NS5A(C)的质粒转染HEK293T细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀,然后用所示抗体进行免疫印迹。 (D用表达FLAG标签的NS5B和NS5A以及TRIM26或TRIM26ΔR的质粒转染HEK293T细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀,然后用所示抗体进行免疫印迹。 (E用表达FLAG标签的NS5B或NS5B K51R和NS5A以及TRIM26的质粒转染HEK293T细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀,然后用所示抗体进行免疫印迹。 NS3和NS5A蛋白水平通过ImageJ进行定量,分别针对其输入蛋白水平进行标准化,并表示为相对于FLAG IP蛋白水平的值。

为了评估TRIM26介导的NS5B泛素化是否影响NS5B-NS5A相互作用,将标记FLAG的NS​​5B,NS5A和TRIM26或TRIM26ΔR表达质粒共转染到HEK293T细胞中,以进行co-IP分析。如图所示 图4D,TRIM26中RING域的删除减少了NS5B和NS5A的相互作用。为了进一步证实,将HEK293T细胞与表达野生型或K51R突变的NS5B以及NS5A和TRIM26一起共转染。如图所示 图4E,NS5B K51R突变减少了NS5B-NS5A的相互作用。总之,这些结果表明,TRIM26介导NS5B的泛素化并促进其与NS5A的相互作用。

TRIM26有助于HCV物种向性

TRIM26在多种动物中表达,并且在不同物种中高度保守(图S10和 图5A)。接下来,我们确定了来自不同物种的TRIM26是否支持HCV复制。我们从无法有效支持HCV复制的小鼠和从报告中度支持HCV复制的树(树sh)中克隆了TRIM26(28)。人,小鼠和tupaia TRIM26(分别称为hTRIM26,mTRIM26和tTRIM26)在对照组和对照组中稳定表达 TRIM26 敲低Huh7细胞(图5B)。用MOI为0.1的HCVcc感染所得细胞,并测定感染后48小时的HCV 核糖核酸水平和NS3蛋白表达。如图所示 图5(C和D),hTRIM26和tTRIM26的异位表达 TRIM26 击倒细胞恢复HCV复制,而mTRIM26的异位表达不能恢复HCV复制。 TRIM26 敲低细胞或对Huh7细胞的HCV感染起显性负作用。

Fig. 5 TRIM26确定了HCV物种的向性。

(A)不同物种的TRIM26蛋白的比对。 (B对照和Huh7-中不同物种的重组TRIM26的蛋白质印迹分析TRIM26 击倒细胞。 (CD)在指定的时间点,将MOI为0.1的HCVcc感染重建的TRIM26细胞。感染后48小时分析HCV NS3蛋白表达(C)和RNA水平(D)。 (E)Huh7-TRIM26 用表达FLAG标签的NS5B的质粒转染用hTRIM26,mTRIM26和tTRIM26重组的敲低细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀,然后用所示抗体进行免疫印迹。 (F对照细胞和Huh7-中重组mTRIM26-del表达的蛋白质印迹分析TRIM26 击倒细胞。 (GH)在指定的时间点,将MOI为0.1的HCVcc感染重建的TRIM26细胞。分析感染后48小时的HCV 核糖核酸水平(G)和NS3蛋白表达(H)。 (I)Huh7-TRIM26 用表达FLAG标签的NS5B的质粒转染用hTRIM26,mTRIM26或mTRIM26-del重构的敲低细胞。细胞裂解物用抗FLAG抗体进行免疫沉淀,然后用所示抗体进行免疫印迹。误差棒代表来自两个独立实验的SD。单向方差分析用于统计分析。 ns, P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P <0.0001。蛋白质水平通过ImageJ进行定量,针对内部肌动蛋白进行标准化,相对于对照(C和H)表示,或针对TRIM26输入蛋白质水平进行标准化,并表示为相对于免疫沉淀的FLAG标记的蛋白质水平(E和I)。

接下来,我们进行了co-IP分析,以确定不同物种的NS5B和TRIM26的相互作用。呵呵7-TRIM26 用FLAG标签的NS5B转染用hTRIM26,mTRIM26和tTRIM26重构的基因敲除细胞。如图所示 图5ENS5B与hTRIM26和tTRIM26相互作​​用,而与mTRIM26的相互作用非常弱。氨基酸序列比对显示,在人类,黑猩猩,猕猴或​​塔皮亚虫的mTRIM26(位于257-262位)中有六个氨基酸的独特插入,而在TRIM26中则没有(图5A 和图。 S10)。为了确定mTRIM26中的六氨基酸插入片段是否影响其在HCV感染中的功能,我们在mTRIM26(指定为mTRIM26-del)中删除了它,并在对照和 TRIM26 敲低Huh7细胞(图5F)。用MOI为0.1的HCVcc感染所得细胞,并测定感染后48小时的HCV 核糖核酸水平和NS3蛋白表达。如图所示 图5(G到H),与全长mTRIM26相比,mTRIM26-del重组在 TRIM26 击倒的细胞部分恢复了HCV复制。一致地,mTRIM26-del获得了与NS5B相互作用的能力(图5I)。总的来说,这些结果表明TRIM26不仅在HCV复制中起作用,而且有助于病毒宿主嗜性。

人类TRIM26增强小鼠肝癌细胞中的HCV感染

最后,我们检查了人类TRIM26是否可以增强通常不支持HCV感染的鼠肝细胞中的HCV复制。为此,我们使用了先前报道的鼠肝癌细胞系Hep56·1D·7A7,该细胞已用CD81,SRBI,CLDN1,OCLN,SEC14L2和miR122重建,它们是HCV感染所必需的宿主因子(29)。首先用hTRIM26或mTRIM26转染Hep56·1D·7A7及其亲本对照Hep56·1D细胞24小时,然后用可在感染后将Gluc分泌到培养上清液中的Gluc标记的HCVcc(JC1-Gluc)感染。通过蛋白质印迹法验证了hTRIM26和mTRIM26的表达(图6A)。收获感染后第0、1、2、3天的培养物上清液用于荧光素酶测定。如图所示 图6B,hTRIM26表达在Hep56·1D·7A7细胞中增强了大约八倍的HCV感染,但在Hep56·1D细胞中未增强,而mTRIM26在两种细胞中均没有作用。为证实这一点,我们建立了通过慢病毒转导稳定表达hTRIM26的Hep56·1D·7A7细胞(称为Hep56·1D·7A7-hTRIM26)。 hTRIM26的表达通过蛋白质印迹法(图6C)。接下来,用HCV感染Hep56·1D·7A7和Hep56·1D·7A7-hTRIM26细胞,然后通过NS5A免疫荧光染色进行分析。如图所示 图6D,尽管两种细胞的感染都不是很有效,但是Hep56·1D·7A7-hTRIM26细胞中有更多的HCV阳性细胞。一致地,流式细胞仪分析表明,HCV感染在hTRIM26转导的Hep56·1D·7A7细胞中更有效,而这种HCV感染在高表达hTRIM26的Hep56·1D·7A7细胞中更明显(图6E)。总之,这些数据表明,hTRIM26重组增强了鼠肝细胞中的HCV感染。

Fig. 6 hTRIM26增强了鼠肝癌细胞中的HCV感染。

(A)在Hep56·1D和Hep56·1D·7A7细胞中hTRIM26和mTRIM26表达的蛋白质印迹分析。 (B在指定的时间点,将用hTRIM26或mTRIM26转染的Hep56·1D和Hep56·1D·7A7细胞以及Huh7细胞用JC1-Gluc感染。收获培养物上清液用于荧光素酶测定。误差棒代表来自两个独立实验的SD。 RLU,相对光单位。 (C)在Hep56·1D·7A7和Hep56·1D·7A7-hTRIM26细胞中hTRIM26表达的蛋白质印迹分析。 (D用HCVcc感染经hTRIM26转染的亲本和Hep56·1D·7A7细胞72小时,然后用抗NS5A抗体(红色)染色以进行免疫荧光显微镜检查。与hTRIM26在同一慢病毒载体中共表达的ZsGreen标记为绿色。误差棒代表来自一个代表性实验的三个孔中来自NS5A阳性细胞数量的SD。 t 测试用于统计分析。 ns, P > 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. (E) Parental, hTRIM26-transuced 他p56·1D·将7A7细胞或Huh7细胞感染HCVcc 72小时,然后用抗NS5A抗体染色,以进行HCV阳性细胞的流式细胞术分析。同时,ZsGreen阳性hTRIM26转导的Hep56·1D·还分析了7A7细胞(占总数的2.8%)。

讨论

宿主因素参与了HCV生命周期的每个步骤。在这项研究中,我们进行了全基因组CRISPR-Cas9筛选,以发现对HCV复制至关重要的宿主因子。从此屏幕中可以识别出多种宿主因素,包括明确定义的HCV进入因素CD81,OCLN和CLDN1(1416)。已证明PPIA对于HCV复制至关重要,并且是HCV的可治疗靶标(17)。 ELAVL1结合HCV 核糖核酸的3'端并保护病毒RNA免受降解(18)。还从以前的基于CRISPR的筛查中鉴定了上述候选物,该筛查也在肝癌细胞系中进行(19)。此外,CSNK1A1负责NS5A的过度磷酸化,对于病毒的产生至关重要(30)。 HCV传播也需要DNA甲基转移酶1(DNMT1),这是建立和维持DNA甲基化的关键因素(31)。总的来说,我们的CRISPR筛选结果与以前的发现高度一致。

我们发现TRIM26是有效HCV复制的关键宿主因素。该结论得到多方面证据的支持。首先,TRIM26的缺乏会降低HCV从多种基因型的复制(Fig. 2 和图。 S5)。其次,TRIM26与病毒聚合酶NS5B特异性相互作用(Fig. 3 和图。 S7)。第三,TRIM26促进NS5B在残基K51处与K27连接的泛素化,从而增强其与NS5A的结合,这是组装病毒复制复合物的关键相互作用(无花果34)。 TRIM26在HCV复制中的作用似乎是病毒特异性的,因为它不参与其他紧密相关的黄病毒(例如DENV和ZIKV)的生命周期(图S6)。重要的是要指出 TRIM26 敲除大大减少了HCV复制,但并没有完全消除它。这意味着可能的冗余主机功能可以弥补TRIM26的不足。

先前的研究表明TRIM26在抗病毒IFN反应的调节中起着重要作用(10, 11)。我们的结果表明,在HCV感染的Huh7细胞中,IFNs和ISGs均未得到明显诱导(图S3)。这一观察结果与先前的许多研究一致,这些研究表明HCV具有多种对抗宿主先天免疫应答的策略(3234)。两组之间的IFN或ISG水平没有差异。 TRIM26 感染HCV后敲低和控制细胞,这进一步排除了TRIM26通过调节IFN信号传导促进HCV复制的可能性。此外,据报道,TRIM26还可以作为HCC的肿瘤抑制因子, TRIM26 击倒促进细胞增殖和转移(35)。我们发现 TRIM26 敲低对人类HCC细胞系Huh7的细胞活力没有影响(图1D)。

HCV非结构蛋白与宿主因子一起形成膜相关的复制复合物,这是HCV基因组复制所必需的。在这项研究中,我们发现TRIM26与NS5B结合,NS5B同时需要TRIM26的SPRY域和NS5B的C端区域(图S8)。 TRIM26介导的NS5B在K51位残基的泛素化增强了NS5B与NS5A之间的相互作用,进而增强了HCV基因组复制(无花果3 和4)。如图所示。 S9A,K51在所有HCV基因型中都是高度保守的。此外,我们在ViPR-HCV数据库中的2045个HCV序列中发现K51保守99.8%,突出了该残基在NS5B生物学功能中的关键作用。 NS5B充当RdRp,其中包含手指,手掌和拇指子域(3638)。尽管NS5B-TRIM26相互作​​用需要C端拇指域,但残基K51位于指环的底部,这对于相互作用不是必需的。但是,手指和拇指子域之间存在广泛的相互作用,从而导致位于中央棕榈子域中的环绕的催化活性位点(3638)。因此,我们推测手指和拇指的交互作用还可以作为TRIM26介导的NS5B在K51残基上泛素化的平台。 NS5B和尿苷5'-三磷酸(UTP)的共晶体结构表明,K51与UTP的三磷酸部分相邻,并与UTP发生静电相互作用(39)。此外,NS5B K51已被证明是RNA合成过程中与新生RNA的接触残基(40)。我们的结果表明,NS5B在残基K51处的泛素化是其与NS5A相互作用所必需的(图4E)。需要进行进一步的研究以调查NS5B K51泛素化是否会影响其与RNA底物的接触。

人类是已知的HCV感染的唯一自然宿主。尽管黑猩猩可以通过实验感染HCV,但从伦理上讲,很难将其用作体内模型来研究该病毒和评估HCV候选疫苗。近年来,在开发支持HCV感染的小动物模型方面取得了很大进展。非啮齿类小型哺乳动物Tupaia(也称为树sh)适度支持HCV感染。但是,其远交遗传背景阻碍了其在HCV动物模型中的应用。小鼠因其近交遗传背景和相关研究工具而成为极好的动物模型,但由于缺乏关键的HCV宿主因子,因此不自然允许HCV感染( 41)。小鼠中人HCV进入因子的重建导致有限的HCV感染(16, 42),这可能会导致小鼠仍然缺乏其他HCV宿主因子。在我们的研究中,我们发现人和tupaia TRIM26能够支持HCV复制,而小鼠TRIM26不能(图5B)。一致地,NS5B与人和Tupaia TRIM26相互作​​用,但与包含小鼠特异性六氨基酸插入物的小鼠TRIM26不相互作用。删除此插入片段可至少部分恢复小鼠TRIM26结合NS5B和支持HCV复制的能力(图5,G和H)。尽管该六氨基酸插入片段(257–262)不在与NS5B相互作用所需的TRIM26的SPRY结构域(294–539)内,但其与SPRY结构域的相对接近性表明该额外的插入片段可能会干扰NS5B进入TRIM26的结合位点。需要对NS5B-TRIM26复合物进行更详细的结构分析。

hTRIM26的表达可以进一步增强Hep56·1D·7A7细胞中的HCV感染,该细胞已经用六种关键的人为因素进行了HCV进入和复制(Fig. 6)。这增加了引入 hTRIM26 进入先前开发的表达人类HCV进入因子CD81,SR-B1,CLDN1和OCLN的转基因小鼠模型(42)可能会进一步增加其对HCV感染的允许性,这是开发完全允许的HCV感染小动物模型的重要步骤。

材料和方法

实验设计

这项研究旨在通过全基因组CRISPR-Cas9筛选来鉴定HCV感染必不可少的宿主因子。在最佳候选人中,TRIM26被确定为HCV感染的新型宿主因子。然后,我们分析了HCV生命周期的哪一步,涉及TRIM26并解释了TRIM26促进HCV复制的潜在机制。最后,我们比较了来自不同物种的TRIM26在HCV感染中的作用,并探讨了其在宿主嗜性中的潜在作用。

细胞培养

HEK293T和Huh7细胞获自中国科学院上海生物科学研究所细胞库。 Huh7.5.1细胞获自Scripps研究所的F. 驰sari。 他p56·1D和Hep56·1D·7A7细胞获自普林斯顿大学的A. 光泽度。将细胞保存在完整的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen)中,该培养基中添加了10%胎牛血清,10 mM 他pes,2 mM l-谷氨酰胺,100 U青霉素/ ml和100 mg链霉素/ ml。所有细胞均在含有5%CO的潮湿空气中培养2 在37°C下。

质粒构建

通过PCR / RT-PCR,分别从含有hTRIM26的质粒(由厦门大学的J. Han提供),鼠L929细胞和tupaia肝组织中扩增人,小鼠和tupaia TRIM26的编码序列。引物:hTRIM26(正向:CGAAAATATCGAACGCCTCAAGGTGGACAAGGGCAGGC;反向:GAGGCGTTCGATATTTTCGACCAGGCTGGCCAGTTGC),mTRIM26(正向:GCGCTCGAGATGGCAGTGTCAGCCCCCTGGAGGAG;反向:GCGGCGCGCGCTCGTCTCGACAGGAGTCTCAGCAGAGTCGTCTCAGCA将扩增的PCR产物克隆到pLVX-IRES-Puro载体或pLVX-IRES-zsGreen载体(图6,C到E)。表达核心NS2,NS3,NS4B,NS5A和NS5B的质粒在N末端包含一个FLAG标签。表达E1和E2的质粒在N端含有信号肽,在C端含有FLAG标签。使用Gibson组装克隆试剂盒[New England Biolabs(NEB),美国],通过同源重组制备了突变的TRIM26和NS5B质粒。通过DNA测序验证所有构建体。

不同HCV基因型的NS5B赖氨酸残基分析

从HCV数据库站点图上下载了不同HCV基因型的NS5B氨基酸,每种基因型的序列数列于图5。 S9。使用Vector NTI和PyMOL分别分析了不同HCV基因型之间NS5B赖氨酸残基的保守性和位置。

sgRNA文库构建和CRISPR筛选

设计了由约180,000个靶向19,271个基因的sgRNA组成的人全基因组sgRNA文库。合成了sgRNA寡核苷酸(CustomArray),并使用sgRNA靶序列侧翼的引物通过PCR从合成的寡核苷酸中扩增了编码sgRNA的DNA片段。纯化扩增的编码sgRNA的DNA片段(DNA Clean&浓缩器TM-5试剂盒(Zymo Research),并通过Golden Gate Assembly连接到表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体中。将质粒转化到trans1-T1感受态细胞中。通过与pCMVR8.74和VSV-G(水泡性口炎病毒糖蛋白)质粒共转染,将质粒文库包装成假型慢病毒颗粒。 Huh7.5-NIrD,在(12用慢病毒载体以0.3的MOI进行转导),并通过荧光激活细胞分选(FACS)(BD FACSAria III)富集表达GFP的细胞,准备在细胞培养2周后进行以下筛选实验。

细胞文库平均分为两部分:参考组和实验组。从参考组中提取基因组DNA,并通过PCR扩增整合到染色体中的sgRNA编码序列,然后进行下一代测序(Illumina HiSeq 2500)。实验组的细胞以0.1的MOI感染HCVcc 30天,在此期间大多数细胞由于HCV复制而死亡。之后,在强力霉素(1μg/ ml)存在下,通过FACS再次富集mCherry阴性细胞。通过深度测序解码来自mCherry阴性细胞的sgRNA序列。用RIGER算法分析实验组和参考组之间sgRNA丰度的比较。低计数读数(少于10个)被过滤掉。

的产生 TRIM26 通过CRISPRi敲除Huh7细胞系

以下三个sgRNA序列用于 TRIM26 通过CRISPRi进行敲低(43)(sg1:GCGGCACCCCTCCTCTCTCA; sg2:GGAATAGCCGGGAGATTACG; sg3:GCTCGTGCAGGAGCGGGACC)。靶向AAVS1转录起始位点(TSS)区域的sgRNA作为对照(AAVS1 sg:CGGAACCTGAAGGAGGCGGC)。将sgRNA克隆到表达GFP的慢病毒载体中,然后通过与pCMVR8.74和pVSV-G质粒共转染到HEK293T细胞中,包装成VSV-G假型慢病毒颗粒。同时,还通过与pCMVR8.74和pVSV-G质粒共转染包装了KRAB-dCas9-P2A-mCherry(Addgene,#60954)载体。然后用表达sgRNA和KRAB-dCas9-P2A-mCherry的假型慢病毒载体转导Huh7细胞。转导后三天,通过FACS分选GFP和mCherry双阳性细胞并进一步培养。通过蛋白质印迹测量TRIM26的敲低效率。

的产生 TRIM26 敲除Huh7.5.1单细胞克隆

寡核苷酸(TRIM26 oligo F:ACCGTGTGGCAACTGGCCAGCCTGG和 TRIM26 合成(Ruibiotech)的TRIM26 sgRNA的oligo R:AAACCCAGGCTGGCCAGTTGCCACA(Ruibiotech),并在50μlTransTaq HiFi Buffer II中退火,最终浓度为9μM。用金门大会(NEB)将退火的寡核苷酸连接到带有嘌呤霉素选择标记的慢病毒载体中。然后将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞(Transgen,CD501)中。通过共转染表达VSV-G的载体pCMVR8.74(包含慢病毒gal / pol)和表达sgRNA的慢病毒载体,可以生成表达sgRNA的假型慢病毒载体。用表达sgRNA的假型慢病毒载体转导Huh7.5.1细胞,并用嘌呤霉素(1μg/ ml)选择。选择对嘌呤霉素具有抗性的单细胞克隆。从单细胞克隆中提取基因组DNA,PCR扩增后通过Sanger测序确认每个细胞克隆中sgRNA / Cas9引起的插入和缺失(indels)。

核糖核酸分离和RT-qPCR

先前描述了用于定量HCV 核糖核酸,人IFN-β,MxA,ISG56和肌动蛋白的引物的方案和序列(34)。将细胞在TRIzol(Tiangen)中裂解,并根据制造商的协议分离RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒(Toyobo)合成cDNA。使用定量PCR SYBR绿色RT-PCR预混液(Toyobo)进行RT-qPCR。靶向DENV和ZIKV的引物的序列如下:ZIKV,CAACTACTGCAAGTGGAAGGGT(正向)和AATGGGTCCATATGATCGGTTGA(反向); DENV,ACAAGTCGAACAA CCTGGTCCAT(正向)和GCCGCACCATTGGTCTTCTC(反向)。靶基因的表达被标准化为肌动蛋白。

病毒制备和滴定

JC1-GLuc病毒的构建方法如先前所述(44)。的 格鲁克 该基因和一个自动裂解肽2A插入JC1 cDNA克隆的p7和NS2之间。 HCVcc,ZIKV和DENV的制备和滴定方法如前所述。简要地说,1×105 将Vero细胞接种到24孔板中24小时,然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤,并用系列稀释的ZIKV感染1小时。病毒接种用1.2 ml含1.5%胎牛血清和1%羧甲基纤维素钠盐的DMEM代替。感染后第4天出现病毒斑块。呵呵7.5.1(1×104将细胞接种在96孔板中,并用连续稀释的DENV感染72小时。将细胞用4%多聚甲醛固定并与针对DENV包膜蛋白的单克隆抗体(克隆D1-4G2-4-15; Millipore)一起孵育,然后与与Alexa Fluor 488偶联的二抗和Hoechst 33258孵育。对染色的细胞进行了分析通过荧光显微镜。

HCVpp感染

HCVpp如前所述产生(22)。用表达HCV包膜糖蛋白,逆转录病毒核心包装成分和荧光素酶的质粒共转染HEK293T细胞。 72小时后收集上清液,并通过0.45-μM孔径的膜过滤。为了感染,将靶细胞接种在96孔板中并用HCVpp感染。感染后72小时,萤火虫荧光素酶活性根据制造商的说明(Promega)通过荧光素酶测定法进行了测量。

联合IP测定

将HEK293T细胞与指定的质粒共转染,并在转染后48小时在含有50 mM tris-HCl(pH 7.5),150 mM NaCl和0.5%NP-40以及蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的NP-40缓冲液中裂解。将细胞裂解液以10,000离心g 在4°C下10分钟,然后将上清液转移至新试管中,并与正常免疫球蛋白G(Santa Cruz Biotechnology)以及蛋白A / G琼脂糖珠在4°C下孵育30分钟,以消除非特异性结合蛋白。 1000离心后g 在4℃下5分钟以去除蛋白A / G琼脂糖珠,将上清液与特异性一抗在4℃下孵育过夜,然后与蛋白A / G琼脂糖珠再孵育2小时。通过在4°C下以1000 g离心5分钟收集样品,用NP-40缓冲液洗涤四次,然后重悬于40μl上样缓冲液中以进行蛋白质印迹。

免疫印迹

该协议如前所述(34)。使用了以下抗体:抗FLAG(Sigma-Aldrich);抗HA和抗肌动蛋白(Abmart);抗TRIM26抗体,山羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)抗体和山羊抗兔HRP抗体(Santa Cruz Biotechnology);针对HCV NS3和NS5A的单克隆抗体(由J. 钟的实验室生成);和抗DENV E蛋白(D1-11,Abcam)。

萤光素酶测定

该协议如前所述(45)。 BioLux高斯荧光素酶测定试剂盒(NEB)用于测量GLuc活性。

免疫荧光显微镜

他p56·1D·7A7细胞(1×104)接种到96孔板中,并用HCV感染72小时。将细胞用4%多聚甲醛固定,并与抗HCV NS5A的单克隆抗体孵育,然后与Alexa Fluor 555偶联的二抗和Hoechst 33258孵育。通过荧光显微镜分析染色的细胞。

共聚焦显微镜

将用所示质粒转染的HEK293T细胞接种在直径14毫米的玻璃盖玻片上48小时。用PBS洗涤细胞,并用低聚甲醛固定1小时。然后,将细胞与第一抗体一起孵育1小时,然后与与Alexa Fluor 488(Invitrogen)或Alexa Fluor 555(Invitrogen)缀合的第二抗体一起孵育。使用Olympus FV1200激光扫描共聚焦显微镜(Olympus,东京,日本)获取图像,并使用ImageJ软件进行分析。皮尔逊的效率是共定位的指标。

细胞活力

Huh7和Huh7-TRIM26 将敲低的细胞接种在96孔板中72小时。然后,获取发光信号用于使用CellTiter-Glo 2.0分析的细胞活力分析。

流式细胞仪

用HCV感染Hep56·1D·7A7,Hep56·1D·7A7-hTRIM26和Huh7细胞。用4%多聚甲醛固定细胞,并与透化缓冲液一起孵育。接下来,将细胞与抗HCV NS5A的单克隆抗体一起孵育,然后与Alexa Fluor 555偶联的二抗一起孵育。通过流式细胞术分析细胞。对于每次染色,至少收集了5000个事件进行分析。 FlowJo软件用于HCV阳性细胞分析。

统计分析

使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。学生们 t 测试用于分析两组之间的差异,然后采用单向方差分析(ANOVA),然后进行Tukey post hoc测试,以分析三组以上的组之间的差异。不重要(ns), P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.

补充材料

有关本文的补充材料,请访问: http://advances.cqonlead.com/cgi/content/full/7/2/eabd9732/DC1

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参考和注释

致谢: 资金: 这项研究得到了中国科学院战略重点研究计划的资助(XDB29010205,授予J.Z.);国家自然科学基金(J.Z.的31670172; W.W.的31930016; Z.Z.的31670169; 是的T.的31770189);北京市科学技术委员会(Z181100001318009),北京大学北京基因组学高级创新中心和北京至清华生命科学中心的支持J.Z.的中国科学院西光基金会(xbzg-zdsys-201909);以及广东省自然科学基金(2019A1515110668) 作者贡献: J.Z.,W.W。和G.Z.构思并设计了研究。 是的L.,G.Z。和Q.L.设计,执行和分析实验。 L.H.和Y.X.为DENV和ZIKV感染实验做出了贡献。 是的G.和G.Z.进行了生物信息学分析。 X。H.,X.Z。和Q.D.有助于建立小鼠肝癌细胞。 W.T.,M.G.,TG。,Y.T。和Z.Z.参加了数据分析。 是的L.和G.Z.起草了手稿。所有作者均对原稿的最终版本做出了贡献并对其进行了修订。 利益争夺: 作者宣称他们没有竞争利益。 数据和材料可用性: 本文和/或补充材料中提供了评估本文结论所需的所有数据。作者可能需要与本文相关的其他数据。
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